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84農(nóng)業(yè)網(wǎng) 時(shí)間：2018-03-15 作者：佚名 來源：網(wǎng)絡(luò)整理
油菜是重要的油料作物，對(duì)油菜的改良是育種家們長(zhǎng)期努力的目標(biāo)。據(jù)報(bào)道，1998年全球轉(zhuǎn)基因油菜種植面積為240x104hm2占全球油菜種植面積的9％，1999年增至280x104hm2，占全球油菜總面積的11％，2000年全球轉(zhuǎn)基因作物面積為4420x104hm2，占全球作物種植面積的16％(官春云，2002)。多年來，許多育種工作者試圖采用傳統(tǒng)的育種手段來獲得油菜良種，但進(jìn)展十分緩慢。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們愈來愈傾向于通過基因工程的手段改良油菜的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性。因此，建立良好的油菜轉(zhuǎn)化體系至關(guān)重要。
1油菜轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)及篩選標(biāo)記
1.1受體系統(tǒng)
植物轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)是指選擇合適的器官、組織或細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后，能通過組織培養(yǎng)或其它途徑再生出新生植株的無性繁殖體系。因此，適宜的油菜轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)的建立，是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因油菜的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
1.1.1子葉、下胚軸受體系統(tǒng)
Moloney等(1989)年發(fā)現(xiàn)蕓薹屬植物種子萌發(fā)以后，切取帶有1-2mm子葉柄末端切口處的細(xì)胞不但再生能力強(qiáng)，而且易被農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化。近年來，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者分別以油菜的子葉、下胚軸、莖段為受體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。Pua等(1987)建立了莖段再生體系，并以此為受體，轉(zhuǎn)化率為10％。Moloney等(1989)以葉柄為受體的轉(zhuǎn)化率為55％。以子葉、下胚軸、莖段為受體，具有簡(jiǎn)便、快速、轉(zhuǎn)化率高f1.5％～55％)等優(yōu)點(diǎn)。但再生植株易為嵌合體，基因型也可能是雜合的(段英姿等，2003)。
1.1.2原生質(zhì)體受體系統(tǒng)
自1972年第一株煙草體細(xì)胞雜種植株問世以來，原生質(zhì)體融合技術(shù)在不斷完善和發(fā)展。油菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)起步于20世紀(jì)70年代，到目前為止，在栽培油菜的3個(gè)種中都利用原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得了再生植株(Chieneta1，1982；Glimeliuak，1984；Puite，19921。以原生質(zhì)體為受體能得到高度純合體，但其再生及分化困難，轉(zhuǎn)化頻率較低，且操作復(fù)雜(段英姿等，2003)。
1.1.3小孢子受體系統(tǒng)
油菜小孢子培養(yǎng)和再生技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)展的比較成熟。小孢子本身具有單細(xì)胞性和單倍體雙重特點(diǎn)。因此用它作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行外源基因?qū)�，不僅有利于基因表達(dá)還可以加速轉(zhuǎn)基因材料的純合，而且可縮短育種年限。陳軍等(1998)以“中雙1號(hào)”、“中雙3號(hào)”、“中油821”、“89008”等油菜品種，建立了甘藍(lán)型油菜游離小孢子再生胚狀體的實(shí)驗(yàn)體系，掌握了受體最佳發(fā)育時(shí)期，使再生頻率高達(dá)每花蕾21.2個(gè)胚狀體，并以此為受體得到轉(zhuǎn)基因植株。
1.2篩選標(biāo)記
在植物轉(zhuǎn)基因工程中，如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體是一個(gè)重要的問題，在油菜轉(zhuǎn)基兇工程中應(yīng)用到許多選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因，使人們能快速、準(zhǔn)確地從大量非轉(zhuǎn)化體中獲得轉(zhuǎn)基因植物。油菜較常用的篩選標(biāo)記基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(程振東等，1994)和二氫葉酸還原酶基因(Puaeta1，1987)及bar基因、Bt基因(衛(wèi)志明等，1998)，它們分別介導(dǎo)對(duì)卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草劑、巴龍霉素的抗性。至于哪一種效果最好一定程度上取決于基因型和可利用的轉(zhuǎn)化載體，研究表明對(duì)不同基因型的篩選效果亦不同。篩選劑最常用的是卡那霉素，應(yīng)用卡那霉素篩選不乏成功的報(bào)道，但有的學(xué)者認(rèn)為(Puaeta1，1987)，卡那霉素對(duì)于甘藍(lán)型油菜來說，有時(shí)效果很差，這可能與基因型有關(guān)。潮霉素、慶大霉素、新霉素應(yīng)用成功報(bào)道亦不少。Schr~der等(1994)研究了在甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化過程中4種選擇標(biāo)記基因(nptⅡ，aadA，bar,Spt)在篩選過程中的效果，認(rèn)為用aadA基因(介導(dǎo)對(duì)鏈霉素和壯觀霉素的抗性)作為標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選最合適。
2油菜轉(zhuǎn)基因方法
在植物基因工程研究中，關(guān)鍵步驟之一是通過特定的方法將外源基因?qū)胧荏w植物細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)生定向的、永久性的遺傳變異，即所謂的植物遺傳轉(zhuǎn)化。為了方便有效地將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)，人們不斷地探索、發(fā)展新的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前應(yīng)用到油菜轉(zhuǎn)基因中的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和外源基因直接導(dǎo)入法。
2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌在侵染植物傷口時(shí)，可將其攜帶質(zhì)粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因組上，并在植物體內(nèi)表達(dá)。因此，農(nóng)桿菌作為一種天然載體系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用到植物基因轉(zhuǎn)化中(表1)，成為植物基因轉(zhuǎn)化的首選方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：不需要專門儀器；宿主范圍廣，包括大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物；插入外源基因的片段較大，可達(dá)50Kb以上；轉(zhuǎn)化率明顯高于其它直接轉(zhuǎn)化方法；外源基因整合到植物基因組上的拷貝數(shù)較少，多為單拷貝；整合的外源基因變異小，后代的分離規(guī)律也遵循孟德爾遺傳規(guī)律。缺點(diǎn)是仍受宿主范圍和菌株特異性等因素的限制(Santar6meta1，1998；TrickandFiner，1998)。
2.2外源基因直接導(dǎo)入法
在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中，有越來越多的研究?jī)A向于采用外源基因直接轉(zhuǎn)化法，因其不受宿主范圍的限制，也不需使用特定的載體。在早期的油菜遺傳轉(zhuǎn)化研究中取得成功的方法有3種：電激法、PEG法和顯微注射法。近年來發(fā)展起來的還有基因槍法、激光微束穿刺法、真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化法和花粉介導(dǎo)法等。
2.2.1電激法
電激法最初是從哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)展起來的一門新技術(shù)，后來用于植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。國(guó)外最早報(bào)道是1985年美國(guó)的Michael等將其用于植物轉(zhuǎn)基因上。Chapel和Gimelius利用電激法將B一葡萄糖醛酸酶基因(gus)導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜的葉肉原生質(zhì)體中，建立了瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。Guerche等(1987)利用此法將含卡那霉素抗性基因nptH導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜中。自此，電激穿孔法先后在煙草、玉米、水稻、馬鈴薯、番茄、大豆、小麥等作物原生質(zhì)體上獲得成功。
2.2.2顯微注射法
顯微注射法是使用專門的儀器將外源基因直接注入到生物的生殖細(xì)胞中，而獲得轉(zhuǎn)基因再生植株的一種方法。顯微注射法多年前在動(dòng)物中就已獲得成功，由此促進(jìn)了它在植物細(xì)胞中的應(yīng)用。Neuhaus等f1987)以甘藍(lán)型油菜的花粉胚為受體，利用顯微注射法將nptll基因的外源DNA注入細(xì)胞中。但這一方法需以精細(xì)的顯微操作技術(shù)和細(xì)胞低密度培養(yǎng)為基礎(chǔ)，并且必須建立固定植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的技術(shù)。
2.2.3基因槍法
基因槍法是借用火藥爆炸、高壓氣體或高壓放電為動(dòng)力，用微粒對(duì)植物進(jìn)行轟擊而將其上的外源基因帶入到植物細(xì)胞內(nèi)，此法可以不受基因型和轟擊靶組織的限制(崔欣等，2001)。目前基因槍法在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中已有成功的報(bào)道。Fukuoka等(1998)利用基因槍法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜小孢子并獲得可育的轉(zhuǎn)化植株。國(guó)內(nèi)方面，侯丙凱利用此法將從蘇云金芽孢桿菌中克隆得到野生型殺蟲晶體蛋白基因?qū)胗汀〔巳~綠體中獲得4株轉(zhuǎn)基因植株(侯丙凱和陳正華，20011。但基因槍方法的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率低，一般在0.1％-1％范圍內(nèi)，增加了選擇的難度，且費(fèi)用昂貴。
2.2.4真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化法
真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化法是一種簡(jiǎn)便、快速、且無需經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)化方法。在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化方面，目前國(guó)內(nèi)已有成功的報(bào)道。張廣輝等(1998)利用真空滲入法，以白菜型油菜子葉為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到其轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化率為2.11％。
2.2.5激光微束穿刺法
激光微束穿刺法是利用聚焦到微米級(jí)的激光微束對(duì)組織進(jìn)行穿刺，引起細(xì)胞膜的可逆性穿孔，從而導(dǎo)入外源DNA的一種基因直接轉(zhuǎn)化技術(shù)。早在1987年，Weber等就利用微束激光將熒光素標(biāo)記的外源DNA導(dǎo)入葉綠體中。這一技術(shù)操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化頻率高，定位準(zhǔn)確，對(duì)細(xì)胞損傷小以及外植體適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)。利用激光微束穿刺法導(dǎo)入植物的外源基因還有一些報(bào)告基因、篩選標(biāo)記基因和抗病基因，侯丙凱首次報(bào)道利用激光微束穿刺法將殺蟲蛋白基因?qū)胗筒�，并獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株的研究結(jié)果。
2.2.6PEG法
PEG融合法操作簡(jiǎn)單，處理量大，融合頻率高，而且不影響再生，基本上已克服了再生植株是嵌合體情況的發(fā)生，而且不需要昂貴的儀器設(shè)備。其缺點(diǎn)是仍需進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)、處理時(shí)問長(zhǎng)、不易掌握、常形成多元原生質(zhì)體融合體。有報(bào)道指出，將PEG法與電擊法等其他導(dǎo)入基因的方法相結(jié)合，能夠提高轉(zhuǎn)化率。程振東等(1994)用PEG法把外源基因?qū)敫仕{(lán)型油菜原生質(zhì)體并獲得了再生轉(zhuǎn)基因植株。
2.2.7花粉介導(dǎo)法
花粉介導(dǎo)法是山西省農(nóng)科院生物中心的孫毅博士，王景雪博士等發(fā)明了一種新的植物轉(zhuǎn)化方法，即利用生殖細(xì)胞――花粉作為載體，結(jié)合超聲波處理介導(dǎo)外源基因?qū)χ参镞M(jìn)行轉(zhuǎn)化。花粉介導(dǎo)法避免了其它轉(zhuǎn)化方法所要求的組織培養(yǎng)技術(shù)，轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單、易操作、轉(zhuǎn)化率高、且費(fèi)用低，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。利用花粉介導(dǎo)法，王景雪等(2001)獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株，隨后解志紅(2002)用這種方法在棉花上進(jìn)行了試驗(yàn)，其轉(zhuǎn)化頻率為32％，杜春芳(2004)將GUS基因轉(zhuǎn)入油菜中，其轉(zhuǎn)化頻率為2.8％。
3油菜轉(zhuǎn)基因研究中的問題與展望
自1985年Ooms等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得第一株轉(zhuǎn)基因油菜以來，轉(zhuǎn)基因油菜的研制在近十多年來發(fā)展迅速，一系列抗病、蟲、除草劑及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因油菜相繼問世，抗蟲和抗除草劑轉(zhuǎn)基因品種已進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)。但是應(yīng)該看到在油菜轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中還存在許多有待解決的問題。
3.1提高外源基因轉(zhuǎn)化率并建立高頻再生體系
目前雖然已獲得了許多轉(zhuǎn)基因油菜植株，但大部分都是經(jīng)過了大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)后僅得到的幾個(gè)轉(zhuǎn)化體克隆。一些轉(zhuǎn)化受體如小孢子、葉綠體等的轉(zhuǎn)化率一般在1％以下。另外一些轉(zhuǎn)化方法如基因槍法、激光微束穿刺法、真空滲入法等，其轉(zhuǎn)化率也很低，均達(dá)不到直接為生產(chǎn)服務(wù)的要求。因此，對(duì)現(xiàn)有的外源基因轉(zhuǎn)化方法作一些改進(jìn)或建立新的基因轉(zhuǎn)化方法，提高轉(zhuǎn)化率，建立高效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)仍然是有待解決的問題。
3．2提高對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜中外源基因的表達(dá)的調(diào)控及其遺傳穩(wěn)定性
目前在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中，外源基因的插入整合基本上是隨機(jī)的，其表達(dá)水平、表達(dá)的部位及時(shí)問也大多不受控制，因此對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控基本上處于失控狀態(tài)。另外，還有由于外源基因的隨機(jī)插入及拷貝數(shù)高而引起轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。解決這些問題就需要深入研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理、采用特定的啟動(dòng)子、使用植物偏好密碼子、研究及應(yīng)用定點(diǎn)插入技術(shù)等方法。
3.3與傳統(tǒng)常規(guī)育種相結(jié)合
利用基因工程方法獲得的油菜轉(zhuǎn)基因植株只是一種人工種質(zhì)新材料，要使其成為生產(chǎn)上可以應(yīng)用的新品種就必須經(jīng)過常規(guī)育種程序的考驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因植株須經(jīng)大田試驗(yàn)將外源基因持續(xù)遺傳給后代，建立遺傳穩(wěn)定的品系，才可能最終取得經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。而在現(xiàn)在的油菜轉(zhuǎn)基因研究中，許多轉(zhuǎn)基因植株未能保存，或不能通過種子將外源基因的性狀遺傳給子代，而且采用的大部分基因?yàn)閳?bào)告基因，沒有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
3.4轉(zhuǎn)基因油菜的安全性問題
隨著基因工程研究的進(jìn)展，許多轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物也進(jìn)入了實(shí)用化、商品化階段，而其安全性問題，也引起了廣泛的爭(zhēng)論，并且受到了各國(guó)政府的高度重視，轉(zhuǎn)基因油菜也不例外地存在安全性問題。轉(zhuǎn)基因油菜中的外源基因可來自植物、動(dòng)物或微生物，一些基因雖已經(jīng)過嚴(yán)格的安全性試驗(yàn)后才被允許進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，但人們對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜仍然心存疑慮。但勿容質(zhì)疑轉(zhuǎn)基因油菜是油菜科學(xué)研究和生產(chǎn)的一場(chǎng)革命�，F(xiàn)存的問題將是推動(dòng)轉(zhuǎn)基因油菜研究走向更加成熟、完善的動(dòng)力，而不是阻力。
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