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84農業(yè)網 時間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網絡整理
養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，使畜禽數量增加，生產性能提高，但畜禽傳染病日趨嚴重，常規(guī)防疫措施有時無能為力。為此該研究承擔“863”項目，開展了基因工程抗病育種的探索。首選對象是危害最大的豬瘟，采用的技術路線是核酶(Riboayme)阻斷病毒基因表達的機制。首先分析我國豬瘟病毒保守基在P80和411個核苷酸(nc)序列，發(fā)現(xiàn)我國石門毒與國外毒株在41Int的區(qū)段中，同源性高達91．50％～96．60％，并且有20個nt長的區(qū)段作為核酶的靶區(qū)。針對該靶區(qū)設計并合成了核酶基因，構建了體外和體內表達載體，并經酶切和序列測定，證明合成的基因、構建的載體與預期的設計相符。將體外表達的核酶分子與豬瘟病毒RNA混合于試管內作用后，病毒RNA分子被切成了預期的兩個片段。體外證明所合成的核酶基因具有活性，將該基因用磷酸鈣沉淀法導入PK50傳代細胞，獲得了抗豬瘟病毒感染能力提高60．2％細胞克隆。經細胞功能驗證后，又將含核酶基因的重組質粒用顯微注射導入家兔受精卵原核。前后共注射444枚受精卵，移植30只受體兔，獲98只后代，經PCR和Southern雜交檢測，其中有6只仔兔整合了導入的核酶基因。為了檢測轉基因兔的實際抗病毒性能，對其中4只接種了100個RID50C株病毒，觀察體溫反應。結果1只動物體溫完全正常，1只僅有0．5℃以下的體溫上升，2只溫度上升不超過1℃。而對照兔和經過轉基因但未整合的兔均有212以上的體溫上升，并呈現(xiàn)典型稽留熱，說明這4含核菌基因的家兔完全或部分抗住了豬瘟病毒感染。將4只抗病毒轉基因兔剖殺，取肝臟用RT―PCR和Northern雜交檢測，在2只兔肝細胞中檢出了外源基因表達的核酶RNA。進一步佐證了外源基因在兔體內表達并阻斷了病毒復制。
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