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豬繁殖與呼吸綜合征的診斷技術(shù)(下)

84農(nóng)業(yè)網(wǎng)　　時間：2018-03-14 　　作者：佚名　　來源：網(wǎng)絡(luò)整理

⑶血清學(xué)檢查

①免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）：將肺泡巨噬細胞加入微量滴定板各孔內(nèi)，待細胞吸附著后，接種PRRS病毒，使每孔僅30％～50％細胞感染，以區(qū)別非特異性血清。經(jīng)過孵育，細胞固定，用于血清學(xué)試驗，每個血清板可用于11個雙份血清檢測。稀釋被檢血清，并在細胞上培養(yǎng)，如果試驗血清中存在抗體，即與巨噬細胞胞質(zhì)中的抗原結(jié)合。在第二次培養(yǎng)階段，結(jié)合的抗體可用抗種的辣根過氧化酶（HPPO）結(jié)合物測定。最后，細胞與顯色液/底物溶液共同培養(yǎng)。用倒置顯微鏡判斷結(jié)果。這種方法特異性強，可測出感染后1～2周至12個月的抗體。

②間接熒光抗體試驗（IFA）：熒光抗體試驗是美國、日本、加拿大等國常用的血清學(xué)檢測方法，抗原制備與免疫過氧化物酶細胞單層試驗相同，可檢測出感染后2～28天的IgM抗體，血清抗體效價低于1∶20者為陰性。

③酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：ELISA具有高度的特異性和敏感性，方便易行，操作過程和結(jié)果判斷能標準化，且適用大規(guī)模的檢測，法國目前已把ELISA法作為監(jiān)測和診斷本病的常規(guī)手段。ELISA方法比IPMA方法能更早的檢測出抗體。該方法可測定感染2周病毒后的抗體。其中，間接ELISA用于檢測血清中抗體，PRRSV抗體，也可檢測抗原。阻斷ELISA（blockingELISA）法可大批量檢測血液樣品中的PRRSV抗體。阻斷ELISA的敏感性和特異性最高。與另外兩種方法相比，它成本較低廉，也更易于大面積推廣。

④血清中和試驗（SN）：本法主要用于檢測PRRS抗體，具有良好的特異性，中和抗體的持續(xù)期比前兩種方法都長，在病毒和待檢血清混合物中加入20％豬血清以添加補體成分，并改變作用溫度和作用時間，可以提高其敏感性。但血清中和試驗需要進行細胞培養(yǎng)，費時費力，實驗要求較高，豬感染PRRSV后，中和抗體出現(xiàn)較晚，所以在感染早期和急性感染的診斷中敏感性會下降。Morrison等（1992）用CL－2621細胞建立了SN試驗方法，與IPMA和IFA相比，SN檢出中和抗體較晚，Yoon等（1994）改良了SN試驗方法，可在人工感染后11天檢出中和抗體。鑒于采用同源毒株和異源毒株進行SN試驗測得的中和抗體效價不同，而且SN方法費時費力，不適用于常規(guī)診斷。

⑷原位雜交法

進行原位雜交的cDNA探針主要是針對PRRSV－ORF7設(shè)計的，可以在肺、淋巴組織、肺泡巨噬細胞、淋巴結(jié)、腎臟的感染細胞內(nèi)檢測到PRRSV，其敏感性高于免疫組化法和免疫膠體金技術(shù)，檢出的持續(xù)時間更長。此外，能夠?qū)RRSV在體內(nèi)器官中的動態(tài)分布情況進行追蹤檢測。根據(jù)不同基因型PRRSV的核酸序列設(shè)計合成不同的探針可區(qū)別不同基因型PRRSV的感染，將不同基因型的探針混合后進行原位雜交，則不同基因型的感染都可檢出。

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