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84農(nóng)業(yè)網(wǎng) 時(shí)間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網(wǎng)絡(luò)整理
1.動(dòng)物的選擇與超數(shù)排卵選用供卵豬和供胚豬；二者均已性成熟，體重為100―140千克。
每日7：00―8：00時(shí)與14：00-15：00時(shí)兩次檢查發(fā)情情況，記錄。然后實(shí)施超排處理。
采用PMSG/hCG法進(jìn)行超排，肌注PMSG750-1000IU，誘導(dǎo)卵泡發(fā)育；72h后，肌注500-1000IUhCG，誘導(dǎo)排卵。于注射hCG后40―49h，收集卵母細(xì)胞。
胚胎供體則在注射hCG后24h和48h交配兩次。妊娠第2天取4細(xì)胞胚胎。
2．卵母細(xì)胞和胚胎的收集
(1)體內(nèi)卵母細(xì)胞和胚胎的收集經(jīng)手術(shù)或屠殺母豬收集卵母細(xì)胞或胚胎。
①麻醉靜注安定注射液14mL。、氯胺酮12mL。手術(shù)過程中，視麻醉狀態(tài)肌注846或用乙醚熏，手后視情況注射強(qiáng)心劑或蘇醒靈。
②手術(shù)以常規(guī)手術(shù)法在中線或兼部開刀，暴露卵巢、輸卵管和子宮。
③沖卵(胚)沖洗方法是從輸卵管傘口沖向子宮―輸卵管結(jié)合部。從輸卵管傘口插入鈍的注射針頭，緩緩?fù)茐鹤⑸淦魇?0-40ml沖卵液(杜氏PBS＋2FCS)注入，慢慢從子宮角收集流出的液體。
在屠殺母豬沖卵時(shí)，于殺豬放血后立即取出輸卵管或子宮，用盛有生理鹽水的保溫杯帶回實(shí)驗(yàn)室。在26―28℃室內(nèi)，用沖卵液沖洗輸卵管和子宮，收集卵母細(xì)胞或胚胎。如卵外有卵丘細(xì)胞，則經(jīng)含300μg／ml透明質(zhì)酸酶的PBS處理幾分鐘，去除卵丘細(xì)胞，洗滌后備用。
(2)體外成熟卵母細(xì)胞的獲得體外成熟的豬卵母細(xì)胞的培養(yǎng)方法見上述體外受精的內(nèi)容。培養(yǎng)成熟后，去除卵丘細(xì)胞，選擇形態(tài)良好并有第一極體的卵母細(xì)胞作為核移植的受體胞質(zhì)。
3．胚胎細(xì)胞核移植
（1）胚胎卵裂球解離將胚胎(一般為桑椹胚階段前的胚胎）置入含1％胰蛋白酶的無蛋白的Hank’s液中作用30s，去除透明帶。再將無透明帶的胚胎轉(zhuǎn)入Hank’s＋10％FCS中37℃培養(yǎng)10min，然后用吸管輕輕吹打，使胚胎解離成游離的卵裂球。
（2）細(xì)胞核移植
①卵母細(xì)胞及游離的卵裂球均置入操作液滴中。
用固定吸管吸住卵母細(xì)胞極體對(duì)側(cè)的胞質(zhì)，調(diào)整注射吸管使之與固定管處于同一水平。將注射管輕輕刺入透明帶，使其輕輕抵在質(zhì)膜上，抽吸出第一極體及其下的內(nèi)容物，輕輕把注射管連同內(nèi)容物拉出透明帶外，完成去核。
②用注射管吸入一個(gè)供核的卵裂球，沿去核時(shí)的孔插入，緩緩將卵裂球放出，然后松開固定管。
③操作完畢后，將注核胚洗3次，在培養(yǎng)滴中培養(yǎng)30min，然后進(jìn)行電融合。
4．電融合先把注核胚轉(zhuǎn)移入0．3mol/L甘露醇融合液中平衡2min后，再移入電極間的融合液中。首先進(jìn)行交流定位，交流脈沖為5V，5―10s；然后，用120V/mm、30μs的直流脈沖刺激一次。最后，將電激后的胚胎移入培養(yǎng)液中，在39℃培養(yǎng)30min，檢查融合結(jié)果。
5．移核胚體外培養(yǎng)在39℃，5％CO2，95％空氣和100％相對(duì)濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4―4.5天，觀察并記錄其發(fā)育情況。
6.胚胎移植麻醉及手術(shù)方法基本同沖卵(胚)操作。受體母豬的發(fā)情期與供卵豬同步。其他見體外受精內(nèi)容。
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